內容提要
0546-7760666
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分析檢測的首要任務(wù)是定性和定量，定性可以說(shuō)是有和無(wú)的問(wèn)題，定量是提供待測物質(zhì)含量范圍的一個(gè)過(guò)程，這當中包含了任何定性定量都有不確定度的含義。而普遍采用的標準曲線(xiàn)已然是分析檢測中的常規工作，本篇內容以講解加問(wèn)答的形式探討標準曲線(xiàn)使用過(guò)程中的難點(diǎn)和誤區，結合數據處理版面關(guān)于標準曲線(xiàn)的問(wèn)題交流，以期答疑解惑、共同精進(jìn)。
內容提要
本文內容共分為【四個(gè)部分】
1、標準曲線(xiàn)的本質(zhì)：系列濃度待測物質(zhì)與響應的關(guān)系，用以推算樣品含量。
2、標準曲線(xiàn)的做法：3點(diǎn)以上，至少重復2次，濃度均勻設置。
3、標準曲線(xiàn)的檢驗：擬合檢驗、失擬檢驗和斜率、截距檢驗。
4、標準曲線(xiàn)使用中的問(wèn)題。
標準曲線(xiàn)的本質(zhì)
分析檢測中的標準曲線(xiàn)是指一系列已知含量（濃度/量）的物質(zhì)與儀器響應/信號之間的關(guān)系，數學(xué)處理就是曲線(xiàn)方程，圖形表示就是標準曲線(xiàn)。標準曲線(xiàn)的目的是可以根據標準曲線(xiàn)查出待測物質(zhì)的含量。當我們得到一系列已知含量的物質(zhì)的響應后，就會(huì )去建立函數關(guān)系，數學(xué)上稱(chēng)曲線(xiàn)擬合，由于直線(xiàn)最為簡(jiǎn)單，所以常常用直線(xiàn)方程加以擬合，當然會(huì )用到多項式擬合等其他方式。 標準曲線(xiàn)的核心問(wèn)題要解決：1、能找到確切濃度的標準物質(zhì)或標準品。2、標準系列和待測物質(zhì)一定要有相同和一致的基體，因為樣品基體可能會(huì )干擾儀器的響應，從這個(gè)意義上講，樣品的前處理實(shí)際就是提供標準和樣品同樣的基體環(huán)境，盡量祛除干擾基體。所以最好的標準系列應該是樣品基體匹配的標準系列。而方法建立過(guò)程中首先要考慮的當然是基體干擾的問(wèn)題，推薦用標準加入曲線(xiàn)和Youden曲線(xiàn)分別考察樣品基體所帶來(lái)的乘積性干擾和加和性干擾。標準加入曲線(xiàn)就是在樣品中加入一系列標準，然后考察該標準加入曲線(xiàn)和標準曲線(xiàn)斜率的統計學(xué)差異，若有差異需考慮用標準加入法定量；而Youden曲線(xiàn)就是對樣品做一系列稀釋?zhuān)缓笥孟♂尡稊等?/10,1/5,1/2,1對儀器響應做曲線(xiàn)，考察該Youden曲線(xiàn)的截距與0的差別，若有差別則提示有加和性干擾，此時(shí)測定值要減去該截距才是真實(shí)值。只有解決了標準曲線(xiàn)與樣品基體的匹配問(wèn)題，我們的定量才可靠。內標法和替代物的使用則是為了解決儀器和前處理的影響問(wèn)題。 標準曲線(xiàn)的做法 按GB/T22554-2010《基于標準樣品的線(xiàn)性校準》推薦： 1、標準曲線(xiàn)的濃度范圍應覆蓋正常操作條件下的被測量范圍； 2、標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致； 3、標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量范圍； 4、標準樣品的個(gè)數至少應有3個(gè)濃度； 5、每個(gè)標準點(diǎn)至少重復2次，這個(gè)重復是指從稀釋開(kāi)始。 如果國家標準有相應的濃度系列推薦，盡量按國家標準，如果你要偷懶，比如我要減少標準點(diǎn)，至少要有理論標準支撐，比如至少要3個(gè)濃度。工作中我們經(jīng)常采用線(xiàn)性校準，因為線(xiàn)性方程最為簡(jiǎn)潔。 標準曲線(xiàn)的檢驗 標準曲線(xiàn)的檢驗是實(shí)際操作中最大的難點(diǎn)，也是工作中誤區和爭議最多的話(huà)題，比如GB/T 5750.3-2006 就將標準曲線(xiàn)的檢驗分為：精密度檢驗，截距檢驗和斜率檢驗，但并未出示具體的檢驗方法。首先講講這三個(gè)檢驗，標準曲線(xiàn)的精密度檢驗，實(shí)際含義就是做出來(lái)的試驗點(diǎn)在我擬合的直線(xiàn)方程左右的分布情況，標準曲線(xiàn)是所有點(diǎn)以最小二乘算法（OLS）擬合出來(lái)的，這條曲線(xiàn)到所有點(diǎn)的垂直距離的和（殘差）是最小的。 因此這條曲線(xiàn)并非通過(guò)所有點(diǎn)而是非常接近所有點(diǎn)，精密度檢驗就是看這些試驗點(diǎn)距離擬合的直線(xiàn)的距離有無(wú)異常，所以也稱(chēng)線(xiàn)性檢驗（擬合檢驗）。這時(shí)的精密度（線(xiàn)性檢驗）需用F檢驗，P<0.05作為線(xiàn)性檢驗合格的標準。 標準曲線(xiàn)的截距檢驗和斜率檢驗分別考察Y=a+bX中a和b與0的統計學(xué)差異，a與0有差別說(shuō)明有試劑空白或系統誤差，而b若與0沒(méi)差別說(shuō)明儀器的靈敏度根本達不到分析要求。日常工作中我們通常用相關(guān)系數來(lái)作為標準曲線(xiàn)好壞的標準，這點(diǎn)有一定道理，但并不全面。 決定系數是相關(guān)系數的平方，就是我們經(jīng)常在儀器軟件中看到的R2或Fit，它提示的是我建立的回歸方程所解釋X對Y變化占Y變量的比值，比如決定系數是0.99也就是說(shuō)我這個(gè)回歸方程可以解釋Y變化的99%，剩下的1%就是殘差。前面提到的精密度（線(xiàn)性檢驗）就是用這兩部分的變化做F檢驗，由于統計檢驗的臨界值比較大，通常0.90以上的相關(guān)系數都會(huì )通過(guò)這個(gè)F檢驗，當然還與實(shí)驗點(diǎn)數（自由度）有關(guān)。 這里要提到GB/T22554-2010《基于標準樣品的線(xiàn)性校準》中關(guān)于失擬檢驗的問(wèn)題，這里的失擬檢驗是要看曲線(xiàn)擬合后剩下殘差與實(shí)驗數據本身隨機誤差（變異）之間的差別，同樣采用F檢驗，此時(shí)失擬檢驗P應該>0.05，也就是說(shuō)殘差應該跟實(shí)驗測定中的隨機誤差（變異）沒(méi)有差別，你要看每次測定的隨機誤差（變異）就必須多次測定同一濃度，因此失擬檢驗要求每個(gè)濃度點(diǎn)至少重復2次。 除此之外，最后我們還要看看這些殘差的分布是否是正態(tài)的，因為正態(tài)才符合隨機誤差的特性。綜上所述，標準曲線(xiàn)的檢驗應該是線(xiàn)性檢驗結合失擬檢驗，以及殘差的正態(tài)性檢驗結合才是統計學(xué)上比較完備的。 通常我們采用的相關(guān)系數0.99以上的說(shuō)法缺乏統計完備性。正如大家經(jīng)常看到的改變擬合的參數個(gè)數，如二次方程明顯能提高相關(guān)系數，但是我們經(jīng)常沒(méi)有勇氣去用二次曲線(xiàn)方程，因為你沒(méi)有統計學(xué)上完備的支撐。如果你發(fā)現標準曲線(xiàn)在低濃度和高濃度點(diǎn)的變異程度不同（非等方差），此時(shí)你應該考慮權重最小二乘(WLS)。 標準曲線(xiàn)使用中的問(wèn)題 4.1 標準曲線(xiàn)需要人為的增加（0,0）點(diǎn)嗎？ 不能。通常的標準系列多是配制0,1,2,3mg/L系列這樣的說(shuō)法，沒(méi)做實(shí)驗人為添加（0,0）很不妥，因為很多時(shí)候0管進(jìn)入儀器可能也有響應值，這也是我們考察試劑空白的一個(gè)重要步驟。這個(gè)0管在某些時(shí)候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來(lái)基體匹配標準系列，如果此時(shí)你用酸做空白或沒(méi)做實(shí)驗人為添加（0,0），那你就很難做好標準曲線(xiàn)。所以標準曲線(xiàn)的0管也是做好標準曲線(xiàn)的重要考慮點(diǎn)。 4.2 標準曲線(xiàn)需要減掉試劑空白來(lái)做嗎？ 不需要。儀器測出來(lái)標準系列的響應值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應值來(lái)做，工作中我們也常用0管來(lái)做儀器調零。其實(shí)沒(méi)有必要那么麻煩，即使空白或0管有響應值，在構建標準曲線(xiàn)時(shí)，我們已經(jīng)認為該響應值就是0濃度，也就是扣除了這個(gè)空白的。 2、從實(shí)際操作講：多用協(xié)方差分析檢驗截距和斜率的差異，以SPSS為例： ①先重新整理數據,將y2數據列加到y1下面,變成一個(gè)變量y;將x2數據列加到x1下面,變成一個(gè)變量x;然后再設定一個(gè)新的分組變量group,原來(lái)第1組值為1,第2組值為2。 ②進(jìn)行協(xié)方差分析(第一步分析斜率是否無(wú)差異).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y—將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x—將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x groupx*group—注意如果變量填入順序不一樣,結果也會(huì )不一樣. Sum ofsquares下拉列表框:選TypeI 然后點(diǎn)擊ok,看結果里x*group這一行的Sig.P值,若大于0.05,則接受原假設,即兩條回歸直線(xiàn)的斜率無(wú)差異,否則拒絕。 ③再來(lái)進(jìn)行截距的無(wú)差異分析其實(shí)過(guò)程跟上面一樣,只是Model里去掉了x*group交叉項.Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y—將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x—將x做為協(xié)變量 Model:選Custom Model:填入 x group—注意如果變量填入順序不一樣,結果也會(huì )不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI 點(diǎn)擊ok后,看group一行的Sig.P值,若P值大于0.05說(shuō)明兩條回歸直線(xiàn)截距也無(wú)差異,若小于0.05說(shuō)明截距是有差異的。 定量限是可以定量檢出的標志，其RSD定為10%，其II類(lèi)錯誤比檢出限小很多。<標準曲線(xiàn)第一點(diǎn)所推算的樣品濃度，是我們儀器比較可信的測定濃度。總之，報告<檢出限，<定量限，<標準曲線(xiàn)第一點(diǎn)所推算的樣品濃度所犯I類(lèi)和II類(lèi)錯誤依次降低，但如果這個(gè)報告結果已經(jīng)超過(guò)你要判斷的限值，那么你的檢測就一點(diǎn)意義都沒(méi)有了。所以現在的檢測單位甚至直接報告小于國家標準規定的限值，從概率統計的角度講，它犯錯誤的幾率最小，但又解決了客戶(hù)的檢測問(wèn)題。
4.3 什么時(shí)候用Y=bX和二次曲線(xiàn)呢？
標準曲線(xiàn)我們通常采用的是Y=a+bX，曲線(xiàn)擬合完必須要做統計檢驗，且要做統計完備的線(xiàn)性檢驗和失擬檢驗，然后再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統計學(xué)上無(wú)差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線(xiàn)，擬合出來(lái)后同樣做線(xiàn)性檢驗和失擬檢驗，如果線(xiàn)性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時(shí)你就可以采用Y=bX。二次曲線(xiàn)的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時(shí)擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿(mǎn)足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統計學(xué)上參數最少的統計簡(jiǎn)潔性原則。
4.4 標準曲線(xiàn)去查含量時(shí)是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？
工作中我們常要減掉空白得到樣品含量，現有國家標準方法有的推薦先算出空白含量，用樣品含量相減，也有推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線(xiàn)推算含量。而且這兩種算法常常差距很大。其實(shí)這種差距往往是低含量水平時(shí)才出現，在低含量水平通過(guò)標準曲線(xiàn)推算含量時(shí)，本身不確定度就很大。這兩種方法都可以。個(gè)人推薦先用樣品信號減空白信號然后去標準曲線(xiàn)推算含量，因為這樣出來(lái)的含量不確定度要小一些，而先算出空白含量再相減就增加了1次標準曲線(xiàn)推算含量時(shí)的不確定度，因為好的測量永遠是不確定度小的測量。
4.5 如何做兩條標準曲線(xiàn)的檢驗呢？
1.先從原理上講：判斷兩條或多條標準曲線(xiàn)的差異，須檢驗殘差，截距和斜率三項，分別有不同的統計學(xué)參數，殘差用F檢驗，截距和斜率采用較為復雜的統計量。
4.6 標準系列的標準溶液體積取用中有效數字該如何寫(xiě)呢？
標準溶液體積取用的有效數字跟你采用的體積量具有直接關(guān)系。比如說(shuō)量取或準確量取等字眼，10mL和10.0mL提示你要采用不同的量具。當我們使用某個(gè)量具完成某次體積取用后，讀數是按照量具的最小允差決定的，而最小允差是針對最小分度線(xiàn)而言的。當取用10mL體積時(shí)，如果用A級10mL的分度吸管，那么10.0mL應該是確定的，因為它的分度線(xiàn)為0.1mL。當取用1mL體積時(shí)，如果用A級1mL的分度吸管，那么1.00mL應該是確定的，因為它的分度線(xiàn)為0.01mL。所以我個(gè)人意見(jiàn)，到底寫(xiě)10.00還是10.0以最小分度線(xiàn)來(lái)確定，最小分度線(xiàn)以下的都為估讀。如果你認為估讀也是有效數字的話(huà)，10.00mL也可以，因為此時(shí)的容量允差為0.05mL，但1.000mL就沒(méi)有太大意義了，因為A級1mL的分度吸管的容量允差已經(jīng)是0.008mL了。
4.7 標準曲線(xiàn)的相關(guān)系數的有效數字該如何保留呢？
GB5750.3-20068.2.7項有如下規定：校準曲線(xiàn)相關(guān)系數只舍不入，保留到小數點(diǎn)后出現非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數點(diǎn)后都是9時(shí)，最多保留小數點(diǎn)后4位。
4.8 標準曲線(xiàn)可以用同一濃度不同體積的進(jìn)樣來(lái)做嗎？
標準系列一般都是配制不同濃度，進(jìn)樣相同體積來(lái)做的（濃度法）。但實(shí)際工作中我們還用到同一濃度來(lái)進(jìn)樣不同體積的方式來(lái)做（體積法），濃度法與體積法的區別在于濃度法中與待測物質(zhì)存在的溶劑/待測物質(zhì)的比例與體積法不同。濃度法中溶劑的環(huán)境（體積）基本是一致的，這樣的好處就是濃度法在判斷溶劑（或溶劑中干擾物質(zhì)）和待測物質(zhì)的指認上更加容易。體積法中干擾物質(zhì)也會(huì )隨標準系列增加，不容易實(shí)現待測物質(zhì)的指認。從進(jìn)樣針，進(jìn)小體積時(shí)不確定度比較大，帶來(lái)的直接結果時(shí)標準曲線(xiàn)不如濃度法容易做直。而且物理體積的限制，體積法不太容易實(shí)現較大跨度的濃度系列設置。總之，體積法和濃度法本質(zhì)上是一致的，但濃度法有：容易做好標準曲線(xiàn)，容易實(shí)現較大濃度跨度和容易實(shí)現待測物質(zhì)的指認等優(yōu)點(diǎn)。
4.9 標準曲線(xiàn)查出樣品是負值，如何報告結果呢？
這種情況下我們一般選擇四種方式報告結果：未檢出，<檢出限，<定量限，<標準曲線(xiàn)第一點(diǎn)所推算的樣品濃度。四種都有道理，實(shí)際區別是埋在四種選擇下面的結果報告人的風(fēng)險。未檢出的全部含義應該是本實(shí)驗室本儀器本方法未檢出，如果沒(méi)有這些界定，未檢出的歧義很多，而且沒(méi)有提供其它任何可用的信息。所以我建議學(xué)生一般不采用這種報告方法；檢出限是定性檢出的標志，它是跟空白的統計比較計算出來(lái)的。每臺儀器，每次測定都有其檢出限，檢出限計算目前有兩大類(lèi)計算方法：?jiǎn)螡舛确椒ê托ＵO計法（Anal.Chem.1997,69:3069)，常規采用的單濃度方法需要額外的工作，所以現在趨向用校正設計法，既利用標準曲線(xiàn)直接計算檢出限，但檢出限I類(lèi)和II類(lèi)錯誤皆控制在0.05。
4.10 空白測出來(lái)是負值，該不該減呢？
空白代表你所選擇的空白對儀器響應/信號的影響，當然可能是正方向和負方向的影響，所以理論上講必須減掉空白。至于是先減空白信號，還是減空白測定值，按國家規定或參見(jiàn)4.4問(wèn)題。
4.11 線(xiàn)性范圍（動(dòng)態(tài)范圍）的最低點(diǎn)和最高點(diǎn)如何確定呢？
配置一系列濃度標準，包括0濃度，從低濃度開(kāi)始擬合當擬合檢驗出現P>0.05的最高的那個(gè)濃度點(diǎn)為止。有也經(jīng)驗說(shuō)當加入的高濃度點(diǎn)在低濃度點(diǎn)構建的直線(xiàn)方程推算的響應超出±10%范圍。關(guān)于線(xiàn)性范圍的最低點(diǎn)應該是0、檢出限或是定量限的問(wèn)題，個(gè)人趨向最低點(diǎn)為0，因為線(xiàn)性范圍只是統計學(xué)上線(xiàn)性的表現，跟能否準確定量是兩方面的問(wèn)題。